추출물의 특성화

목적 및 도전 

추출물이 생성되면 다음 목적은 추출물의 철저한 화학적 특성화를 수행하는 것입니다. 위에서 설명한 바와 같이 임계치를 설정하는 것은 SCT와 같은 안전 고려 사항을 기반으로 할 수 있으며; 추출된 구성요소 또는 재료의 조성에서 알려진 화학 첨가제의 명목 수준을 포함하는 기능적 고려사항; 또는 알려진 또는 결정된 분석 기술, 기기 또는 방법의 민감도와 같은 기술적 고려사항에 기반할 수 있습니다. 추출물 평가의 전체 목표를 실현하기 위해 추출 연구의 추출물 특성화 단계를 가능하게 해야 합니다.

위에서 정의한 철저한 추출물 특성화의 궁극적인 목적은 최첨단 분석 화학이 최상의 기술과 성실함으로 실천되어도 모든 경우에 실현될 수 없습니다. 사실상 모든 유기 및 무기 추출물 화학 엔터티를 발견, 식별 및 정량화하는 데 능한 분석 기술 또는 분석 기술 조합이 없습니다. 일부 경우에는 유기 추출물에 대한 확인을 위한 진정한 참조 화합물이 사용할 수 없을 수 있거나, 정량적 기기 보정을 위해 사용할 수 없을 수 있습니다. 

따라서 추출물 특성화의 실용적인 목적은 따라서 지정된 수준 또는 임계값 이상에서 추출물에서 존재하는 모든 개별 추출물 화학 엔터티의 발견, 식별 및 정량화에 대한 과학적 확신의 합리적인 정도로 성실하게 노력해야 합니다.

추출물 특성화에 관련된 과정

1. 스카우팅

스카우팅 작업에서 가장 유용한 분석 기술은 특정 추출물 또는 추출물의 화학 클래스의 분자 구조에 특정한 화학 정보를 제공하지 않기 때문에 화합물 특정이 아닙니다. 이러한 분석 기술은 추출물의 유기 및/또는 무기 화학 엔터티의 대량 화학적 특성에 대한 정보를 제공하며, 이 정보는 추출물의 발견, 식별 및 정량화를 안내하는 데 사용될 수 있습니다. 스카우팅 분석은 적용되는 스카우팅 기술 또는 기술 조합에 관계없이 추출물 특성화의 실용적인 목표를 달성할 수 없습니다. 스카우팅에 사용할 수 있는 분석 기술은 표 3에 나열되어 있으며, 각 기술에서 사용할 수 있는 특정 대량 화학 속성(및 이 속성의 잠재적 이용)도 나열되어 있습니다. 스카우팅의 유용성에 대한 일부 예는 다음과 같습니다:

• 중량 분석에 의해 결정된 비휘발성 잔류물의 상당한 수준은 추출물에 상당한 수준의 무기 화학 엔터티가 있음을 제안할 수 있습니다. 추출된 비휘발성 잔류물(잔류물 발화)을 이용한 재분석 후 상당한 질량이 남아있다면 이 제안이 강화될 것입니다.

• 추출물의 상당한 자외선 흡수는 그들의 분자 구조 내에 자외선 크로마토그램이 포함된 유기 화학 엔터티가 존재함을 나타냅니다. 예를 들면, 페놀계 항산화제와 같습니다.

• 이 추출물의 적외선 스펙트럼의 특징적인 특성은 존재하는 유기 추출물의 화학 클래스에 대한 더 상세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 통찰력은 스카우팅 과정에서 제안된 추출물의 화학 클래스를 탐지하기 위해 분석 방법을 개발하고 적용하는 데 사용될 수 있습니다.

• 수성 추출물의 경우, 총 유기 탄소는 존재하는 유기 추출물의 총량을 측정합니다.

• 스카우팅 과정과 스카우팅 분석은 추출물 특성화에 선택 사항입니다. 스카우팅의 유용성은 발견, 식별 및 정량화를 위한 안내에서 잠재적으로 제공됩니다.

Identification of an extractable can be accomplished either by structural analysis or qualitative analysis. Structural analysis is the process by which the molecular structure of an unknown analyte is elucidated from compound-specific data, and therefore requires compound-specific detection of the unknown analyte. A compound-specific detector is one that provides information specific to the molecular structure of the individual unknown analyte (not just its chemical class). Qualitative analysis is the process by which an unknown analyte is matched with an authentic reference compound via one or more analytical techniques. 

The analytical techniques used for qualitative analysis can, but do not need to be, compound specific.The analytical techniques most applicable to structural analysis, and to trace organic analysis problems in general, involve the combination of chromatography with mass spectrometry. These are the so-called “hyphenated” techniques of GC/MS and high-performance liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS). A discussion of the principles of mass spectrometry (including both GC/MS and LC/MS) is available in Mass Spectrometry <736>.Both GC/MS and LC/MS are capable of generating extractables profiles in the form of chromatograms. 

However, since LC/MS includes a relatively high chemical background of HPLC mobile phase ions, it is typical to include a non-destructive UV detector in series with the mass spectrometer to assist in locating peaks of individual extractables. The compound-specific data available from mass spectrometry include:

• The monoisotopic molecular weight of the extractable based on confirmation of the molecular ion from one or more ionization processes
  
• The molecular formula of the extractable based on accurate mass measurements, and/or accurate isotope ratio measurements, of the molecular ion
  
• The fragmentation behavior of the extractable based on in-source fragmentation or tandem mass spectrometry

GC/MS interfaced with electron ionization produces mass spectra which can be searched through computerized databases, or libraries, of mass spectra from known compounds. Note that searchable mass spectra are generally unavailable for LC/MS ionization processes because of the variable nature of such spectra over time and between various instruments and laboratories. Both GC/MS and LC/MS also include the retention time (or retention index) of the unknown extractable which can be compared with that of authentic reference compounds.

Given the number and chemical diversity of organic extractables, it is unreasonable to expect that authentic reference compounds will be available (or can be made available) to confirm every identification. It is therefore necessary that levels of identification confidence be established and appropriately utilized. Data typically available from GC/MS and LC/MS analyses (see items a through e below) are used to designate individual extractables identifications in the categories of Confirmed, Confident, or Tentative (2 ):

1. Mass spectrometric fragmentation behavior/expert mass spectrum interpretation
2. Confirmation of molecular weight
3. Confirmation of elemental composition
4. Mass spectrum matches automated library or literature spectrum
5. Mass spectrum and chromatographic retention index match authentic reference compound
6. Supporting spectral information from an orthogonal method (e.g., NMR)

   
   

• A Tentative identification means that data have been obtained that are consistent with a class of molecule only. This is typically the case when only information such as a or d is available.

• A Confident identification means that the tentative identification has been bolstered by additional and sufficient confirmatory information to preclude all but the most closely related structures. This would be the case, for example, if the tentative information (a and/or d) were augmented by b, c, or f. The more confirmatory information obtained, the greater the level of confidence.

• A Confirmed identification means that the preponderance of evidence confirms that the entity in question can only be the identification that is provided. Although it is possible that a highly confident identification may meet the standard implied by the preponderance of evidence (for example, having a, b, c, e, and f), the only means of providing a confirmed identification is via mass spectral and retention time match with an authentic reference compound (item e).

Although these identification categories are based on mass spectrometry, it is possible to use data from other analytical techniques to assist in extractables identification. Such techniques include GC/FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) and LC/NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy). These and potentially other analytical techniques are capable of producing compound-specific data which are complementary to mass spectrometry.

The level of identification required for any individual extractable depends on the intended use of that identification. It is up to the organization responsible for the extraction study to determine this after appropriate consideration of applicable regulatory guidances.

Since the list of potential inorganic extractables, such as trace elements and metals, is finite compared with the population of organic extractables, identification and quantitative analysis for inorganic extractables are achieved simultaneously. While elemental analysis is relatively straightforward, it is not without its challenges. The issue of false positive responses and spectral or mass interference must be addressed in order for identifications based on atomic spectroscopy to be rigorous and accurate. It is also noted that elemental analysis provides element-specific identifications and quantitations, and not the chemical speciation of the extractable. 

Thus, interpretation of the impact of the elemental results may require further studies, such as detailed chemical speciation of elements deemed of significance. For example, while finding sulfur in an extract by atomic spectroscopy is an important outcome, the safety impact of this finding cannot be ascertained until the speciation of the sulfur is established. This is the case as the safety impact of sulfur as elemental sulfur may be different than that of sulfur as sulfate.

4. QUANTITATION

Quantitation is typically based on the instrumental response of an individual extractable relative to an authentic reference compound, and therefore requires that individual extractables be separated (either directly with chromatography or indirectly with selective detection) and produce detector responses that are directly proportional to the level (or concentration) of the extractable in a given extract. Calibration of an analytical system is accomplished by analysis of authentic reference compounds (external standards). One or more internal standards can also be included in both the extract and reference calibration solutions to increase accuracy and precision. 

The levels of extractables for which authentic reference compounds are not available can be estimated using their responses (or response factors) relative to internal standards, or other surrogate reference compounds of similar molecular structure. 

While such an analytical process can provide reliably accurate concentration estimates, diligence must be exercised in terms of establishing and justifying the choice and use of internal standards. Criteria for the selection of appropriate internal standards have been described (2).

Preparation of Extracts for Analysis

Extracts can often be analyzed directly without significant preparation or concentration. Many organic solvent extracts (e.g., dichloromethane, ethyl acetate, hexane) can be directly injected into a gas chromatograph, while others (e.g., methanol, ethanol, isopropanol) are either too reactive in the heated GC injection port or too high boiling. 

Organic solvent extracts with inappropriate physical/chemical properties for direct analysis by GC can be switched to more appropriate solvents. Certain extractables, such as fatty acids (e.g., palmitic acid, stearic acid) perform better in gas chromatographic analysis when they are derivatized to either methyl esters or trimethylsilyl esters.It is usually considered inappropriate to directly analyze aqueous extracts by gas chromatography, due to the reactivity and high boiling point of water. In addition, pH-buffered aqueous extracts contain nonvolatile salts which are not suitable for GC injection. 

Aqueous extracts are typically back extracted with an organic solvent to remove organic extractables from the water, with the resulting organic extract being injected into the GC. Unlike GC, liquid chromatography (HPLC, LC/MS) is perfectly suited to the direct analysis of aqueous extracts, since most HPLC methods include water and water-miscible mobile phases. Water-immiscible organic solvents (e.g., hexane) cannot be injected onto these reversed-phase HPLC systems, so these must be dried and the resulting extractable residue taken up in a solvent suitable for HPLC (e.g., acetonitrile, methanol, or mixtures of these with water).

Organic or aqueous extracts with insufficient levels of extractables for analysis can be concentrated by various techniques. Many organic solvents can be dried down under inert gas, a rotary evaporator, or a Kuderna-Danish concentrator. Aqueous extracts can be lyophilized, concentrated under vacuum, or back extracted into an organic solvent which is then further concentrated.

The final concentration at which an extract is analyzed depends on the goal(s) of the extractables assessment and the inherent sensitivities of the analytical techniques applied. A good “rule of thumb” is that in order to accomplish a complete structural analysis of an unknown extractable, a GC/MS requires approximately 5 ng injected into the instrument. This suggests a concentration in the injected extract of 5 ng/µL or 5 µg/mL. In a 200-mL dichloromethane extract, this converts to a total of 1 mg of this particular extractable recovered from the extracted test article. If this analyte concentration is insufficient to meet the goal of the extractables assessment, then the following parameters can be optimized:

• Extraction stoichiometry (i.e., extract more material or use more extracting solvent)
  
• Extraction conditions (i.e., use higher temperatures, longer times, solvents with greater extraction power, more aggressive extraction technique, etc.)
  
• Extract processing (i.e., concentration of the extract)

3. 식별 

추출물의 식별은 구조 분석 또는 정성 분석을 통해 달성될 수 있다. 구조 분석은 알려지지 않은 분석물의 분자 구조를 화합물 특정 데이터에서 파악하는 과정이며, 따라서 알려지지 않은 분석물의 화합물 특정 검출이 필요하다. 화합물 특정 검출기는 개별 알려지지 않은 분석물의 분자 구조에 특정한 정보를 제공하는 것이다(단순히 그 화학 클래스만이 아니다). 정성 분석은 알려지지 않은 분석물이 하나 이상의 분석 기법을 통해 진품 참조 화합물과 일치하는 과정이다. 

정성 분석에 사용되는 분석 기법은 화합물 특정이 될 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다. 구조 분석에 가장 적용 가능한 분석 기법, 그리고 일반적으로 흔적 유기 분석 문제에는 크로마토그래피와 질량 분석의 결합이 포함된다. 이것들은 GC/MS와 고성능 액체 크로마토그래피/질량 분석(LC/MS)의 이른바 "하이픈 연결" 기법이다. 질량 분석의 원리에 대한 논의는 Mass Spectrometry 〈736〉에서 찾을 수 있다. GC/MS와 LC/MS 모두 크로마토그램의 형태로 추출물 프로필을 생성할 수 있다. 

그러나 LC/MS는 HPLC 이동 단계 이온의 상대적으로 높은 화학적 배경을 포함하므로, 개별 추출물의 피크를 찾는 데 도움을 주기 위해 질량 분석기와 함께 파괴되지 않는 UV 검출기를 일련으로 포함하는 것이 전형적이다. 질량 분석에서 사용 가능한 화합물 특정 데이터에는 다음이 포함된다: 

• 하나 이상의 이온화 과정에서의 분자 이온 확인을 기반으로 한 추출물의 단일 도포 분자량입니다.
• 분자 이온의 정확한 질량 측정 및/또는 정확한 도포비 측정을 기반으로 한 추출물의 분자 공식입니다.
• 원천 내 파편화 또는 순차 질량 분석을 기반으로 한 추출물의 파편화 행동입니다.

GC/MS는 전자 이온화와 결합되어 사용되며, 알려진 화합물의 질량 스펙트럼 라이브러리나 컴퓨터화된 데이터베이스를 통해 검색할 수 있는 질량 스펙트럼을 생성합니다. 주의할 점은 LC/MS의 이온화 과정에 대한 검색 가능한 질량 스펙트럼은 시간과 다양한 기기 및 실험실 간의 변동성 때문에 일반적으로 사용할 수 없다는 것입니다. GC/MS와 LC/MS 모두 알려지지 않은 추출물의 보유 시간(또는 보유 지수)를 포함하며, 이는 진품 참조 화합물과 비교할 수 있습니다.

유기 추출물의 수와 화학적 다양성을 고려할 때 모든 식별을 확인하기 위해 진품 참조 화합물이 사용 가능하거나 사용 가능하게 될 것으로 예상하는 것은 비현실적입니다. 따라서 식별의 확신도 수준을 설정하고 적절히 활용하는 것이 필요합니다. 일반적으로 GC/MS와 LC/MS 분석에서 사용할 수 있는 데이터(아래의 항목 a부터 e까지 참조)는 개별 추출물의 식별을 확인, 확신 또는 잠정(2) 범주로 지정하는 데 사용됩니다:

a. 질량 분석적 파편화 동작/전문 질량 스펙트럼 해석

b. 분자량 확인

c. 원소 구성 확인

d. 자동 라이브러리 또는 문헌 스펙트럼과의 질량 스펙트럼 일치

e. 진품 참조 화합물과의 질량 스펙트럼 및 크로마토그래피 보유 지수 일치

f. 직교 방법(예: NMR)에서의 지원 스펙트럼 정보

"Tentative identification"은 데이터가 분자의 클래스와만 일치한다는 것을 의미합니다. 일반적으로 a나 d와 같은 정보만 사용 가능할 때입니다.

"Confident identification"은 잠정적 식별이 추가적이고 충분한 확인 정보에 의해 강화되었음을 의미하며, 이 정보로 인해 가장 가까운 구조를 제외한 모든 것이 배제됩니다. 예를 들면, 잠정 정보(a 및/또는 d)가 b, c, 또는 f에 의해 보완되는 경우입니다. 확인된 정보가 많을수록 신뢰도는 높아집니다.

"Confirmed identification"은 주요 증거의 우세가 질문의 주체가 제공된 식별과만 일치함을 확인한다는 것을 의미합니다. 높은 확신을 가진 식별이 주요 증거의 우세를 의미하는 기준을 만족시킬 수 있지만(예: a, b, c, e 및 f를 가진 경우), 확인된 식별을 제공하는 유일한 방법은 진품 참조 화합물과의 질량 스펙트럼 및 보유 시간 일치를 통한 것입니다.

질량 분광법을 기반으로 한 이러한 식별 카테고리들에도 불구하고, 추출물의 식별에 도움을 주기 위해 다른 분석 기법의 데이터를 사용할 수 있습니다. 이러한 기법에는 GC/FTIR (푸리에 변환 적외선 분광법) 및 LC/NMR (핵자기 공명 분광법)이 포함됩니다. 이 기법들은 질량 분광법을 보완하는 화합물 특정 데이터를 생성할 수 있는 능력이 있습니다.

개별 추출물에 대한 필요한 식별 수준은 그 식별의 의도된 용도에 따라 다릅니다. 적용 가능한 규제 지침을 적절히 고려한 후 추출 연구를 담당하는 조직이 이를 결정하는 것입니다.

잔량 원소와 금속과 같은 잠재적 무기 추출물의 목록은 유기 추출물의 집단과 비교할 때 유한하기 때문에, 무기 추출물의 식별과 양적 분석은 동시에 이루어집니다. 원소 분석은 상대적으로 간단하지만, 도전적인 문제가 없는 것은 아닙니다. 원자 분광법을 기반으로 한 식별이 엄격하고 정확하게 이루어지려면 거짓 양성 반응 및 스펙트럼 또는 질량 간섭 문제를 해결해야 합니다. 원소 분석은 원소 특정 식별과 양정을 제공하며 추출물의 화학적 종을 제공하지 않는다는 것도 주목할 만합니다. 

따라서 원소 결과의 영향 해석은 중요하다고 간주되는 원소의 상세한 화학 종 분석과 같은 추가 연구가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 원자 분광법으로 추출물에서 황을 찾는 것은 중요한 결과이지만, 이러한 발견의 안전 영향은 황의 종이 확립될 때까지 확정될 수 없습니다. 이는 원소 황으로서의 황의 안전 영향이 황산염으로서의 황과 다를 수 있기 때문입니다.

4. 4. 정량

정량은 일반적으로 개별 추출물의 계측 반응이 정통 참조 화합물에 상대적으로 기반을 두고 있으므로, 개별 추출물을 분리해야 합니다(직접 크로마토그래피로 또는 선택적 검출로 간접적으로) 그리고 검출기 반응이 주어진 추출물 내 추출물의 수준(또는 농도)에 직접 비례하여 생성되도록 해야 합니다. 분석 시스템의 보정은 정통 참조 화합물(외부 표준)의 분석을 통해 이루어집니다. 정확도와 정밀도를 높이기 위해 추출물과 참조 보정 용액에 하나 이상의 내부 표준도 포함될 수 있습니다.

정통 참조 화합물이 사용할 수 없는 추출물의 수준은 내부 표준 또는 유사한 분자 구조를 가진 다른 대리 참조 화합물에 상대적인 그들의 반응(또는 반응 계수)을 사용하여 추정할 수 있습니다.

이러한 분석 과정은 신뢰할 수 있는 정확한 농도 추정치를 제공할 수 있지만, 내부 표준의 선택과 사용을 확립하고 정당화하는데 있어 주의를 기울여야 합니다. 적절한 내부 표준 선택을 위한 기준이 설명되었습니다(2).

분석을 위한 추출물 준비

추출물은 종종 큰 준비나 농축 없이 직접 분석될 수 있습니다. 많은 유기 용매 추출물(예: 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 헥산)은 가스 크로마토그래프에 직접 주입될 수 있지만, 다른 것들(예: 메탄올, 에탄올, 이소프로판올)은 가열된 GC 주입 포트에서 반응하기 너무 활발하거나 끓는점이 너무 높습니다. 

GC로 직접 분석하기에 적절하지 않은 물리/화학적 성질을 가진 유기 용매 추출물은 더 적합한 용매로 바뀔 수 있습니다. 특정한 추출물들, 예를 들면 지방산(예: 팔미트산, 스테아릭산)은 메틸 에스터나 트리메틸실릴 에스터로 변환될 때 가스 크로마토그래피 분석에서 더 좋은 성능을 보입니다. 보통 가스 크로마토그래피로 수성 추출물을 직접 분석하는 것은 불합리하다고 여겨집니다, 이는 물의 반응성과 끓는점 때문입니다. 또한, pH-버퍼된 수성 추출물에는 GC 주입에 적합하지 않은 비휘발성 염이 포함되어 있습니다. 

수성 추출물은 일반적으로 물에서 유기 추출물을 제거하기 위해 유기 용매로 다시 추출되며, 그 결과 유기 추출물이 GC에 주입됩니다. GC와는 달리, 액체 크로마토그래피(예: HPLC, LC/MS)는 대부분의 HPLC 방법이 물과 물 섞임성 이동상을 포함하기 때문에 수성 추출물의 직접 분석에 완벽하게 적합합니다. 물에 불용성인 유기 용매(예: 헥산)는 이 역상 HPLC 시스템에 주입될 수 없으므로, 이러한 용매는 건조하고, 결과적으로 발생하는 추출물 잔류물은 HPLC(예: 아세토니트릴, 메탄올 또는 물과의 혼합물)에 적합한 용매로 취득되어야 합니다.

분석을 위한 추출물의 추출 농도가 부족한 경우 여러 기술로 농축할 수 있습니다. 많은 유기 용매는 불활성 가스, 회전 증발기, 또는 Kuderna-Danish 농축기 아래에서 건조할 수 있습니다. 수성 추출물은 동결 건조, 진공 하에서 농축, 또는 추가로 농축되는 유기 용매로 다시 추출하여 농축할 수 있습니다.

분석될 추출물의 최종 농도는 추출 물질 평가의 목표와 적용된 분석 기술의 고유한 민감도에 따라 달라집니다. 좋은 경험적 법칙은 알려지지 않은 추출물의 완전한 구조 분석을 수행하기 위해서는 GC/MS에 대략 5ng가 기기에 주입되어야 한다는 것입니다. 이것은 주입된 추출물의 농도가 5ng/µL 또는 5µg/mL임을 제안합니다. 200mL의 디클로로메탄 추출물에서는, 이것은 추출된 시험 품목에서 회수된 이 특정 추출물의 총량이 1mg임을 의미합니다. 이 분석물 농도가 추출물 평가의 목표를 충족시키지 못하면, 다음과 같은 매개변수를 최적화할 수 있습니다:

• 추출 스토이치오메트리 (즉, 더 많은 물질을 추출하거나 더 많은 추출 용매 사용)
• 추출 조건 (즉, 더 높은 온도, 더 긴 시간, 더 큰 추출 능력을 가진 용매, 더 공격적인 추출 기술 등 사용)
• 추출물 처리 (즉, 추출물 농축)